在鏡檢時,人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象,這就需要顯微鏡的各項光學技術(shù)參數(shù)達到一定的標準,并且要求在使用時,要根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣,才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能,得到滿意的鏡檢效果。
顯微鏡的光學技術(shù)參數(shù)包括:數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好,它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的,在使用時,應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系,但應(yīng)以保證分辨率為準。
1.數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑簡寫NA,數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù),是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低的重要標志。其數(shù)值的大小,分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。
數(shù)值孔徑(NA)是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率(n)和孔徑角(u)半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下:NA=nsinu/2
孔徑角又稱"鏡口角",是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度??讖浇窃酱螅M入物鏡的光通亮就越大,它與物鏡的有效直徑成正比,與焦點的距離成反比。
顯微鏡觀察時,若想增大NA值,孔徑角是無法增大的,辦法是增大介質(zhì)的折射率n值。基于這一原理,就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡,因介質(zhì)的折射率n值大于1,NA值就能大于1。
數(shù)值孔徑值為1.4,這個數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達到了JI限。目前,有用折射率高的溴萘作介質(zhì),溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。
這里要指出,為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用,在觀察時,聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。
數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系,它幾乎決定和影響著其他各項技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比,與放大率成正比,與焦深成反比,NA值增大,視場寬度與工作距離都會相應(yīng)地變小。
2.分辨率
顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的很小間距,又稱"鑒別率"。其計算公式是:σ=λ/NA
式中σ為很小分辨距離;λ為光線的波長;NA為物鏡的數(shù)值孔徑??梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大,照明光線波長越短,則σ值越小,分辨率就越高。要提高分辨率,即減小σ值,可采取以下措施
(1) 降低波長λ值,使用短波長光源。
(2) 增大介質(zhì)n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。
(3) 增大孔徑角u值以提高NA值。
(4) 增加明暗反差。
3.放大率和有效放大率
由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大,所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積:Γ=βΓ1
顯然,和放大鏡相比,顯微鏡可以具有高得多的放大率,并且通過調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡,能夠方便地改變顯微鏡的放大率。
放大率也是顯微鏡的重要參數(shù),但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的JI限即有效放大倍率。
分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關(guān)系式:500NA<Γ<1000NA
當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu),此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像,稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力,應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。
4.焦深
焦深為焦點深度的簡稱,即在使用顯微鏡時,當焦點對準某一物體時,不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度內(nèi),也能看得清楚,這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層,而焦深小,則只能看到被檢物體的一薄層,焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系:
(1) 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。
(2) 焦深大,分辨率降低。
由于低倍物鏡的景深較大,所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。
5.視場直徑
觀察顯微鏡時,所看到的明亮的圓形范圍叫視場,它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度,是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大,愈便于觀察。有公式 F=FN/β式中F: 視場直徑,F(xiàn)N:視場數(shù)(Field Number, 簡寫為FN,標刻在目鏡的鏡筒外側(cè)),β:物鏡放大率。由公式可看出:
(1) 視場直徑與視場數(shù)成正比。
(2) 增大物鏡的倍數(shù),則視場直徑減小。因此,若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌,而換成高倍物鏡,就只能看到被檢物體的很小一部份。
6.覆蓋差
顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標準,光線從蓋玻片進入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變,從而產(chǎn)生了相差,這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。
國際上規(guī)定,蓋玻片的標準厚度為0.17mm,許可范圍在0.16-0.18mm,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標的0.17,即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。
7.工作距離
工作距離也叫物距,即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時,被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此,它與焦距是兩個概念,平時習慣所說的調(diào)焦,實際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下,工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡,其工作距離小。