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中科院生物物理所在超分辨顯微鏡研制領(lǐng)域取得進(jìn)展,你怎么看?

返回列表 來源:本站 發(fā)布日期:2023-03-24 14:55:05【


圖片1.png 

 

哺乳動物的DNA復(fù)制是在許多復(fù)制起點(diǎn)開始的,這些復(fù)制起點(diǎn)聚集在整個(gè)基因組的數(shù)千個(gè)復(fù)制域(RD)中。然而,目前尚不清楚每個(gè)RD內(nèi)的復(fù)制起源是隨機(jī)激活還是優(yōu)先在某些染色質(zhì)特征附近激活。

一.研究介紹

為了了解單個(gè)人類細(xì)胞中的DNA復(fù)制是如何在亞RD水平上調(diào)節(jié)的,作者使用STORM以超高分辨率直接可視化和定量表征跨S期的單個(gè)復(fù)制點(diǎn)(RFi)的時(shí)空組織、形態(tài)和原位表觀遺傳特征,揭示了RFi傳播動力學(xué)的分級徑向模式。

結(jié)合模擬和生物信息學(xué)分析,指出了一種“CTCF組織的復(fù)制繁殖”(CoREP)模型,該模型表明早期S期亞RD水平復(fù)制激活的非隨機(jī)選擇機(jī)制,由CTCF有組織的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)為局部表觀遺傳環(huán)境在協(xié)調(diào)基因組DNA復(fù)制中的關(guān)鍵作用提供了重要的見解。

二.研究結(jié)果(節(jié)選)

在S期的特定階段,向細(xì)胞提供染料標(biāo)記的dUTP或EdU,將這些類似物分子結(jié)合到分裂期中DNA中,用STORM對標(biāo)記的RFi進(jìn)行成像,揭示了點(diǎn)狀分布以及跨S期,STORM(20 nm) 提供的好的空間分辨率能夠?qū)Fi進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量表征,特別是對于基于數(shù)十納米內(nèi)多色共定位分析的后續(xù)發(fā)現(xiàn)。

 

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圖1. 跨S期RFi的STORM成像和定量表征

單個(gè)HeLa細(xì)胞核中RFi的常規(guī)和STORM圖像,在S期的五個(gè)不同階段(從左到右,每個(gè)階段有30分鐘的標(biāo)記)。插圖(紅色框)顯示每個(gè)階段單個(gè)RFi 的放大代表性圖像。頂部的橙色條表示S期標(biāo)記周期的相對時(shí)間位置。

為了研究以亞衍射JI限分辨率復(fù)制DNA的局部染色質(zhì)環(huán)境中的動態(tài)變化,作者使用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Cy3B原位共標(biāo)記RFi和與各種表觀遺傳特征相關(guān)的七個(gè)關(guān)鍵核標(biāo)記,并進(jìn)行雙色STORM成像以量化它們的共定位。在這些標(biāo)記中,已知CTCF通過形成染色質(zhì)環(huán)來調(diào)節(jié)3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu),組蛋白修飾的H3K27ace和H3K4me3與轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)相關(guān),核層定位的層粘連蛋白 A/C主要與轉(zhuǎn)錄抑制的DNA 相關(guān),而SUZ12構(gòu)成組蛋白H3的抑制復(fù)合物的一部分,增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是哺乳動物復(fù)制的重要組成部分,它與H2B一起作為陽性對照

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圖2. RFi相關(guān)表觀遺傳特征在S期原位的動力學(xué)

(A–G)RFi和七個(gè)關(guān)鍵核標(biāo)志物之間的共定位分析揭示RFi在整個(gè)S期的不同局部染色質(zhì)狀態(tài)。在S期早期(頂部),中期(中間)和晚期(底部)開始時(shí)標(biāo)記的新復(fù)制DNA(粉紅色)的細(xì)胞,隨后用針對每個(gè)標(biāo)記物(綠色)的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記,并用雙色STORM成像。

為了探測單個(gè)RFi的空間組織和動力學(xué),作者研究DNA復(fù)制在空間和時(shí)間上的傳播模式。為此,在S期三個(gè)不同階段的兩個(gè)連續(xù)30分鐘時(shí)間窗口內(nèi)用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Atto 550標(biāo)記新復(fù)制的DNA,此外,核層中的層粘連蛋白A/C用第三種染料Atto 488。在標(biāo)記細(xì)胞的多色STORM成像中,兩個(gè)時(shí)間窗口的相對空間分布揭示了RFi進(jìn)展的獨(dú)特時(shí)空模式。

 

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圖3. S期早期和晚期的RFi表現(xiàn)出相反的傳播動力學(xué)時(shí)空模式

30分鐘窗口(紫色和綠色)內(nèi)新復(fù)制的DNA(紫色:第Y個(gè)窗口;綠色:第E個(gè)窗口;白色:共定位RFi)與層粘連蛋白A/C(藍(lán)色)一起標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞的核邊界。頂部的紫色和綠色條表示S期標(biāo)記周期的相對時(shí)間位置。插圖(編號為1到6)顯示放大區(qū)域(紅色框),顯示兩種顏色之間的正常對比度(頂部)和增強(qiáng)對比度(中),以獲得更好的可視化效果。

為了理解RFi傳播獨(dú)特模式背后的機(jī)制基礎(chǔ),CTCF通過形成染色質(zhì)環(huán)在調(diào)節(jié)3D基因組結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的突出作用,作者使用RNA干擾物降低HeLa細(xì)胞中的CTCF表達(dá),使用免疫染色在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了這一點(diǎn),結(jié)果表明,CTCF及其介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)是RFi形態(tài)和傳播動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

 

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圖4. CTCF調(diào)節(jié)RFi形態(tài)和時(shí)空傳播動力學(xué)

(A)用非特異性對照(NC)或CTCF siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核中S期早期RFi的STORM圖像。插圖(藍(lán)色)顯示了CTCF在RNA干擾下的成功下調(diào)。(D)在用NC或CTCF siRNA處理的細(xì)胞核的S期早期開始時(shí),在兩個(gè)連續(xù)的30分鐘窗口(紫色和綠色)中標(biāo)記的新復(fù)制DNA的雙色STORM圖像。

總之,作者的研究為進(jìn)一步詢問DNA復(fù)制和其他相關(guān)核內(nèi)過程的時(shí)空組織和動力學(xué)鋪平了道路,為理解復(fù)制和轉(zhuǎn)錄之間的耦合提供了一個(gè)框架,因?yàn)檗D(zhuǎn)錄活性啟動子周圍的開放染色質(zhì)可以促進(jìn)附近復(fù)制起源的選擇,這可能反過來解釋轉(zhuǎn)錄活性基因傾向于早期復(fù)制的觀察結(jié)果。

 

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